Pichia pastoris

TUGAS MIKROBIOLOGI PANGAN

Pichia pastoris

Oleh :

Innes Arum P                          22030110120019

Riani Arifin                             22030110130066

Nadya Syafa N                       22030110130067

Devi Cahya Sukma                 22030110141019

PROGRAM STUDI ILMU GIZI FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG

2012

Teknologi mutakhir yang memanfaatkan khamir jenis Pichia pastoris adalah sebuah sistem sukses yang tinggi untuk produksi dari berbagai variasi protein rekombinan. Beberapa faktor yang berkontribusi terhadap penerimaannya secara acak, yang terpenting meliputi: (1) sebuah promoter yang berasal dari gen oksidasi alkohol 1 (AOX1)  dari P.pastoris yang unik sesuai untuk mengontrol ekspresi dari gen asing; (2) kesamaan teknik yang dibutuhkan untuk manipulasi genetik molekuler dari P.pastoris terhadap Saccharomyces cerevisiae; (3) lebih menyukai kekuatan dari P.pastoris untuk pertumbuhan respiratory, sebuah kunci sifat fisiologi yang memfasilitasi kulturnya secara hebat pada densitas sel yang tinggi relatif untuk khamir fermentasi; dan (4) diskusi pada 1993 oleh Phillips Petroleum Company di Bartlesville, Okla (dan dilanjutkan oleh Research Corporation Technologies (RCT)), untuk menciptakan sistem ekspresi P.pastoris terhadap laboratorium akademi penelitian, konsekuensi dari sebuah ledakan yang telah terjadi pada pengetahuan berbasis sistem sebagai penggambaran angka  publikasi sebelumnya.

Sebagai sebuah khamir, P.pastoris merupakan mikroorganisme bersel tunggal yang mudah untuk memanipulasi dan mengkulturkan. Tapi P.pastoris juga eukariot dan sanggup terhadap banyak modifikasi post-translational yang ditampilkan dengan sel eukariotik tertinggi  seperti proses proteolitik, penggandaan, pembentukan tulang disulfida dan glikosilasi. Selain itu, banyak protein yang di ujung atas  sebagai badan inklusi yang tidak aktif  pada sistem bakterial yang diproduksi sebagai molekul biologi aktif pada P.pastoris. Sistem P.pastoris juga pada umumnya menjadi lebih cepat, mudah dan tidak mahal untuk digunakan daripada sistem ekspresi yang berasal dari eukariot yang lebih tinggi seperti pada sistem sel kultur jaringan insekta dan mamalia dan biasanya memberikan level ekspresi yang lebih tinggi.

Pada pendahuluan yang pendek ini, kami mereview aspek-aspek dasar dari sistem ekspresi P.pastoris.

Sejarah dari sistem ekspresi P.pastoris

Kemampuan yang dimiliki oleh spesies khamir untuk mrnggunakan etanol sebagai sumber carbon dan energi yang diperbarui lebih dari 40 tahun yang lalu oleh Koichi Ogata. Karena metanol dapat disintesis secara murah dari gas alami (methane). Itu merupakan imediasi yang menarik pada penggunaan organisme tersebut untuk menggenerasi yeast biomass atau  single cell protein (SCP) untuk dipasarkan secara primer sebagai makanan tinggi protein hewani. Selama 1970, Phillips Petroleum Company mengembangkan media dan metode untuk pertumbuhan P.pastoris pada methanol yang selanjutnya megkultur densitas sel yang tinngi (<130 g/l dry cell weight). Tetapi, selama periode yang sama, harga dari methane naik secara dramatis keduanya terhadap krisis minyak dan harga dari kacang kedelai, sumber alternatif terbesar dari makanan protein hewanim menurun. Sebagai kesimpulan,  proses SCPtidak pernah berkompetisi secara ekonomis.

Pada 1980, Phillip Petroleum dikontrak dengan Salk Institute  Biotechnology/Industrial Associate Inc. (SIBIA), sebuah kumpulan bioteknologi yang berlokasi di La Jolla, Calif untuk mengembangkan P.pastoris sebagai sistem ekspresi gen heterologo. Penelitian- penelitian di SIBIA mengisolasi gen AOX1 (dan promotrnya) dan mengembangkan vektor, strain dan metode untuk manipulasi genetik molekuler dari P.pastoris. Kombinasi dari kekuatan meregulasi ekspresi dibawah kontrol dari promoter AOX1  bersama dengan pengembangan media dan metode fermentasi untuk SCP proses dihasilkan pada level tinggi dengan pukulan dari protein asing pada P.pastoris. Pada 1993 Phillip Petroleum menjual posisi patennya dengan sistem ekspresi P.pastoris kepada RCT, pemilik paten yang berlaku. Ditambah, Phillip Petroleum mengizinkan Invitrogen untuk menjual komponen dari sistem terhadap peneliti-peneliti dunia luas, sebuah penyelenggaranya melanjutkan di bawah RCT.

P.pastoris sebagai sebagai Methylotrophic Yeast

P.pastoris adalah salah satu dari kira-kira satu lusin spesies khamir yang mewakili empat perbedaan genus yang sanggup memetabolisasi methanol. Genus yang lain termasuk Candida, Hansenula dan Torulopsis. Jalur matabolik methanol memperlihatkan kesamaan pada semua khamir dan meliputi sebuah set unik dari jalur enzim-enzim. Step awal pada metabolisme methanol adalah oksidasi dari methanol menjadi formaldehyde, menggenerasi hidrogen peroxide pada proses, oleh enzim alkohol oksidase (AOX). Untuk menghindari toksisitas dari hidrogen peroksida, langkah awal ini pada metabolisme metanol ditempatkan dalam sspesialisasi organela, yang disebut peroxisome, yang mengasingkan jalan toksik hidrogen peroksida dari peristirahatan sel. AOX adalah homo-octomer dengan subunit lain yang mengkontaminasi satu loncatan kofaktor FAD non kovalen (flavin adenine di-nucleotide). Alkohol oksidase memiliki afinitas rendah untuk O₂ dan methylotrophic yeast terlihat untuk mengkompensasi defisiensi ini oleh sanitasi  luas dari jumlah enzim.

Ada dua gen pada P.pastoris yang dikode untuk AOX- AOX1 dan AOX2 tapi gen AOX1 bertanggung jawab untuk mayoritas yang sangat besar dari aktivitas alkohol oksidase di dalam sel. Gen AOX1 diregulasi secara rapat dan diinduksi oleh methanol dengan level tinggi. Pada kultur methanol-grown-shake-flask, level ini bertipe sekitar 5 persen dari total protein larut tapi dapat ≥ 30 persen dalam sel pamakan methanol pada laju batas pertumbuhan kultur pemfermentasi. Ekspresi dari gen AOX1 dikontrol pada level transkripsi. Pada sel pertumbuhan methanol, kira-kira 5 persen polyA+RNA dari gen AOX1 padahal di sel pertumbuhan sumber karbon yang lain, pesan AOX1 tidak dapat dideteksi. Regulasi dari gen AOX1 mirip dengan regulasi gen GAL1 dari S. cerevisiae yang dikontrol kemunculan dari keterlibatan dua mekanisme: sebuah mekanisme represi/ de-represi ditambah mekanisme induksi. Tetapi, tidak seperti regulasi GAL1, kondisi de-represi tidak menghasilkan pada substansi transkripsi dari gen AOX1. Persen methanol nampak esensial untuk menginduksi tramskripsi pada level tinggi. 

Sekresi protein heterolog

Protein heterolog dapat di ekspresikan secara intraseluler maupun di sekresikan ke dalam medium oleh P.pastoris. Karena protein endogen yang disekresikan hanya dalam kadar rendah dan medium kultur yang digunakan tidak ditambahkan protein, protein heterolog merupakan sebagian bsar protein yang disekresikan. Maka dari itu, proses sekresi adalah tahap pertama pemurnian yang merupakan pemisahan protein asing dari protein utama seluler. Meskipun demikian, tahap sekresi biasanya dibatasi karena protein asing tersebut biasanya disekresi oleh khamir itu sendiri. Sekresi ini membutuhkan adanya suatu sinyal pada protein asing sebagai reseptor sehingga proses dapat berlangsung dengan baik. Sekresi sinyal dari S.cerevisiae telah berhasil digunakan dalam proses ini.

Beberapa protein asing pada medium tumbuhnya P.pastoris dapat didegradasi secara cepat oleh enzim protease, yang merupakan faktor yang sangat berpengaruh dalam proses degradasi, karena pengaruh lingkungan tempat spesies ini tumbuh. 

Ekspresi Gen yang Umum

Semua ekspresi gen dari spesies ini merupakan turunan dari NRRL-Y 11430. Semua strain dalam spesies ini dapat tumbuh dalam media yang kompleks namun memerlukan suplementasi histidin atau nutrisi lain yang sesuai untuk dapat tumbuh dalam medium.

Modifikasi post translasi

P.pastoris mempunyai kemampuan dalam modifikasi post translasi yang dihubungkan dengan eukariotik tingkat tinggi, termasuk di dalamnya glikosilasi. Proses glikosilasi ini merupakan maslah atau proses yang tidak dikehendaki pada beberapa spesies fungi dan mamalia, termasuk manusia. Glikosilasi pada spesies ini dan beberapa jenis fungi berbeda dengan glikosilasi yang terjadi pada makhluk hidup eukariotik tingkat tinggi, dilihat dari komposisi yang terjadi antara protein dengan jenis gulanya maupun dilihat dari senyawa-senyawa kimia yang memulai proses glikosilasi tersebut.

Pada mamalia, glikosilasi merupakan ikatan yang terjadi antara protein dengan beberapa jenis gula seperti galaktosa dan asam sialat. Berbeda dengan proses yang terjadi pada mamalia, pada makhluk hidup tingkat rendah seperti P.pastoris proses glikosilasi merupakan ikatan yang terjadi antara protein dengan hanya satu jenis residu oligosakarida yaitu manosa.

Jumlah residu manosa, jenis ikatan serta frekuensi dan spesifitas atau karakteristik glikosilasi pada P.pastoris telah lama diidentifikasi.

Beberapa jenis protein asing yang disekresi oleh P.pastoris mengandung karbohidrat lebih banyak yang dapat mengakibatkan terjadinya proses glikosilasi juga lebih sering terjadi dan makin berat kerusakan yang diakibatkannya.

Ikatan antara oligosakarida manosa dengan suatu protein asing oleh beberapa jenis khamir merupakan masalah besar dalam industri-industri farmasi, antara lain berupa tumbuhnya antigen dalam jumlah besar pada mamalia dan dapat dihilangkan dari darah melalui sistem kerja hati.

Beberapa jenis P.pastoris dapat ditunjukkan oleh gambar – gambar di bawah ini.